www.biotechugamg.fora.pl

n3l · Wysłany: Nie 23:29, 22 Mar 2009 Temat postu: Pierwsze cwiczenia

Po kole ze stezen facet powiedzial, ze pierwsze cw sa z nim a wg rozpiski w niejakim skrypcie jest napisane ze pierwsze cw to fag lambda. Czy ktos wie o co kaman?

Aś · Wysłany: Nie 23:38, 22 Mar 2009 Temat postu:

mi gdzieś dźwięczy że słyszałam coś w stylu "na pewno pierwsze ćw będą o fagu lambda"

aga_b · Wysłany: Pon 0:02, 23 Mar 2009 Temat postu:

mi tez sie wydaje ze wlasnie on prowadzi faga

Natalia · Wysłany: Pon 0:14, 23 Mar 2009 Temat postu:

A ja myśle, ze jak wytrzymasz Ola do wtorku rano to będziesz miała informacje z pierwszej reki

Na forum powinien byc panikometr, tak jak jest "ile razy pomógł" Very Happy

Robert · Wysłany: Pon 15:58, 23 Mar 2009 Temat postu:

>Na forum powinien byc panikometr, tak jak jest "ile razy pomógł" Very Happy

dobre, jestem za xD

Lukasz · Wysłany: Pon 21:38, 23 Mar 2009 Temat postu:

o ile pamiętam on mówił, że ma przetrwalniki...

aga_b · Wysłany: Pon 22:29, 23 Mar 2009 Temat postu:

a no moze:D ja tam sie nie znam;P jutro sie wywiemy.
Natalia, umiesc ta rozpiske co dzis robilas kto kiedy ma cwiczenia.

Natalia · Wysłany: Pon 23:06, 23 Mar 2009 Temat postu:

gr 1

7 IV, 28 IV, 12 V, 26 V

gr 2

22 IV, 6 V, 20 V, 3 VI

gr 3

8 IV, 29 IV, 13 V, 27 V

gr 4

21 IV, 5 V, 19 V, 2 VI

To są narazie nasze przypuszczenia zrobione na podstawie planu

grzesiek · Wysłany: Wto 12:15, 24 Mar 2009 Temat postu:

Daty cwiczen podane przez Natalie zostaly dzisiaj potwierdzone, dr Obuchowski ma zamiescic je tez w extranecie.
A tematem pierwszych cwiczen jest fag lambda

Justyna

Oto pytania z pierwszych ćwiczeń dotyczących faga lambda z tamtego roku:

Gr.1
1. Mutacje w genach cI i hflA - liza czy lizogenia i dlaczego?
2. Sposoby indukcji profaga
3. Co to jest antyterminacja i jak jest wykorzystywana przez faga?
4. Po co chloroform w doświadczeniu z lizą?
5. Różnice między integracją i wycięciem genomu faga.
Gr.2
1) porownac jakie warunki faworyzuja rozwoj lityczny a jakie rozwoj lizogeniczny bakteriofaga
2) co to jest plon fagowy
3) zadanko dotyczace m.o.i.
4) porownac zasade wspoldzialania bialka CI i cro i ktore co faworyzuje.
5) co sie stanie gdy do komorki zakazonej fagiem lambdabedacym w stanie lizogenii bedzie chcial wlezc inny fag lamda.
Gr.3
co promuje lize lub lizogenie?
2.co bierze się pod uwage przy projektowaniu bakteriofaga jako wektora.
3.Mechanizm pakowania DNA do głowek.
4. na czym polega mechanizm retroregulacji.
Gr.4
dlaczego wektory fagowe mogą być lepsze od tradycyjnych Smile

co to jest replikacja model toczącego się koła
co to jest intasom,
co robią białka P i O i jakie są ich odpowiedniki w E. coli
co się stanie gdy brak glukozy w pożywce gospodarza (czy jakoś tak) i skutki mutacji w S, CII (chyba) i jeszcze jakiejś innej.

aga_b

Przed sekunda znalazlam jeszcze cos takiego:

Wyjaśnij termin: plon fagowy.
Wyjaśnij w jaki sposób promieniowanie UV doprowadza do indukcji profaga w komórce bakteryjnej.
Uzasadnij celowość wprowadzania mutacji w geny kodujace białka kapsydu bakteriofaga lambda.
W oparciu o jaki ‘mechanizm molekularny’ funkcjonuje kaskadowy system regulacji genów bakteriofaga lambda? – uzasadnij.
Wyjaśnij termin: centra infekcyjne.
Wyjaśnij w jaki sposób uboga pożywka stymuluje wejście faga lambda na drogę lizogenii.
Uzasadnij celowość wprowadzania mutacji w geny lizogenii.
W oparciu o jaki mechanizm molekularny funkcjonuje regulacja genów warunkująca rozwój oraz utrzymanie stanu lizogenii przez faga lambda. Uzasadnij.
Wyjaśnij termin:wirus łagodny
Co oznacza termin indukcja profaga i jakie czynniki mogą go wywoływać?
Na podstawie bakterifoga lambda wyjaśnij na czym polega zjawisko odporności komórek lizogennych na zakażenie?
Co należy wziąć pod uwagę planująć klonowanie z wykorzystaniem wektorów pochodnych bakterifaga lamda?

Nie wiem co to za pytania i skad, ale podejrzewam ze od nas, bo nie wiem kto inny moglby miec biologie molekularna;D

Mateusz

To moje wersje odpowiedzi - uzupełniać i szukać błędów Razz

Grupa 1
1. Mutacje w genach cI i hflA - liza czy lizogenia i dlaczego?
cI - mutacje oznaczają wejście w cykl lityczny. Jeśli jest zmutowany nie łączy sie z operatorami oL i oR. Przez to nie blokuje transkrypcji genu N, którego produkt stymuluje powstanie genów O, P (odpowiedzialnych za replikację DNA) i Q włączającego geny póxne cylku litycznego. Zbaleziono też temperaturowrażliwą wersja białka cI która denaturuje przy około 45 stopniach (i skutkuje to wejściem na szlak lizy). Istnieje także mutacja białka cI dająca mu odpornośc na cięcie przez RecA co utrudnia wejście na drogę lityczną już wbudowanego faga.
hflA - mutacje oznaczają promocję cylku lizogenicznego. hflA (tak samo jak hflB) jest bakteryjną proteazą, która bardzo szybko rozkłada białko cII bedące aktywatorem lizogenii. W przypadku gdy białko to jest rozkładane w mniejszym stopniu zgromadzenie wystarczającej jego ilości (do zapoczątkowania lizogenii) jest łatwiejsze

2. Sposoby indukcji profaga
Indukcja profaga to jego wycięcie z genomu gospodarza i (w domysle) wejście na droge lityczną. Najłatwiej uzyskać ją uszkadzając DNA bakterii (np za pomocą promieniowania UV lub indukcji chemicznej), co wywoła u bakterii tzw odpowiedź SOS. Białko tej odpowiedzi - RecA - degraduje (lub tylko promuje degradację/jest antagonistą - nie jestem pewien, ale info w Sambrooku wg mnie wskazuje na to, że właśnie RecA tnie) represor CI co skutkuje transkrypcją genów (w tym cro będącego represorem genu cI), wycięciem materiału genetycznego faga i wejściem na drogę lizy komórki.
Indukcja może dośc rzadko zachodzić też samoczynnie, najcześciej tuż po podziale komórki, z częstością 10^-4 na generację.
(zakładamy, że nie mamy żadnej dziwnej mutacji w białku cI - patrz ostatnie 2 strony tego fragmentu z Sabmrooka)

3. Co to jest antyterminacja i jak jest wykorzystywana przez faga?
Antyterminacja - zjawisko polegające na ignorowaniu przez polimerazę RNA terminatorów transkrypcji. Zachodzi dzięki łączeniu się jakiegoś białka z polimerazą, co zmienia jej konformację. U faga lambda takimi białkami są białka regulacyjne N i Q. Antyterminacja indukowana białkiem N prowadzi do transkrypcji wczesnych genów, a Q póxnych genów. Reguluje to czas powstania poszczególnych białek, dzięki czemu liza komórki zachodzi wystarczająco póxno, by fag zdażył zsyntetyzować nowe wirusy.

4. Po co chloroform w doświadczeniu z lizą?
Chloroform niszczy błony komórkowe bakterii, dzięki czemu otrzymujemy lizat zawierający fagi, do wysiania na agarze górnym, co pozwala określić ilość fagów.

5. Różnice między integracją i wycięciem genomu faga.
Integracja zachodzi dięki wysokiemu stężeniu białka cII, które aktywuje transkrypcję genów cI i Int, a także transktypt antysensowny w stosunku do genu Q. Do integracji potrzebne są 2 białka: kodowana przez faga integraza (Int) i kodowany przez gospodarza czynnik integracji (integration host factor, IHF)
Wycinanie zachodzi w przypadku degradacji białek cI, wymaga ono Int a także Xis (bacteriophage lambda excisionase). Istotny jest tu także rejon sib, który sprawia, że ekspresja genu int jest niska (poprzez cięcie mRNA promotora pL przed genem int i jego szybką degradację), by fag przypadkiem znowu nie włączył się do DNA komórki.

Grupa 2
1. Porownac jakie warunki faworyzuja rozwoj lityczny a jakie rozwoj lizogeniczny bakteriofaga
lityczny:
mała ilośc fagów na komórkę (najlepiej jeden)
bogata pożywka
uszkadzanie DNA bakterii (nie wiem, czy to też się liczy)
lizogeniczny:
duża ilośc fagów na komórkę (5-10)
uboga pożywka

2. Co to jest plon fagowy
plon faga - statystyczna liczba potomnych cząstek fagowych uwalnianych z pojedynczej zainfekowanej komórki bakteryjnej

4. Porownac zasade wspoldzialania bialka CI i cro i ktore co faworyzuje.
Białko cI i cro działają antagonistycznie na regulowane przez siebie promotory: pL i pR (konkurują ze sobą). Oba hamują syntezę białek z tych promotorów, ale na różne sposoby.
cro ma mniejsze powinowactwo do pL i pR, przyłącza się do nich dopiero gdy jest go w komórce dośc dużo, dzięki temu może powstać wystarczająca ilośc białek wczesnych by doprowadzić do lizy. Największe powinowactwo wykazuje wobec promotora pM, który jest promotorem białka cI, dzięki czemu hamuje jego syntezę. Faworyzuje lizę.
cI łączy się z większym powinowactwem do operatorów oL i oR blokując transkrypcję wczesnych genów. Białko to aktywuje też, łącząc sie do oR1 i oR2, swoją syntezę z promotora pM. Do tego promotora ma znacznie mniejsze powinowactwo i łączy sie z nim dopiero, kiedy jego steżenie w komórce jest wysokie w ten sposób przerywa swoją synteże i utrzymuje swoje steżenie na stałym poziomie. Faworyzuje lizogenię.

5. Co sie stanie gdy do komorki zakazonej fagiem lambdabedacym w stanie lizogenii bedzie chcial wlezc inny fag lamda.
Fag (jefo DNA) wniknie do komórki, ale białka cI powinno być wystarczająco dużo, by związać się różnież z operonami tego faga i uniemożliwić mu przeprowadzenie lizy.

Grupa 3
1. Co promuje lize lub lizogenie?
Patrz wyżej 2.1

2. Co bierze się pod uwage przy projektowaniu bakteriofaga jako wektora.
Szczerze mówiąc, nie wiem za bardzo i nigdzie nie mogłem znaleźć Sad

Ma ktoś jakiś pomysł? Mi przychodzi do głowy:
- bakteriofagi są specyficzne (lambda wnika tylko do E. Coli)
- moga przenosić DNA tylko do określonej długości (około 20 kbp)

3. Mechanizm pakowania DNA do głowek.
Podczas lizy tworzą się "preheads" (prokapsyd) razem z białkiem który jest dla nich rusztowaniem (scaffolded prehead). Dalsze dojrzewanie, podczas którego usuwane jest białko rusztowania, jest zależne od białka groE, tworzonego przez gospodarza. W wyniku tego powstaje prokapsyd. Pakowanie do niego DNA wymaga produktów genów Nu1 i A, łączą sięone z DNA kontaktamerycznym (czyli tym powstającym przez toczące się koło, mającym kilka kopii genomu) obok lewego miejsca cos. Dwie sekwencje cos zbliżają się do siebie i do wejścia do główki gdzie są cięte przez białko A tworząc lepkie końce. Kompleks ten (te 2 białka i DNA) łączy się do określonego miejsca na prokapsydzie. W obecności białka F1 DNA jest wtłaczane do główki (reakcja ta jest zależna od ATP). Na końcu białko D łączy się od zewnątrz z główką zamykając ją.

4. Na czym polega mechanizm retroregulacji.
Retroregulacja to hamowanie ekspresji danego genu po transkrypcji tego genu. U faga lambda ulega temu mechanizmowi gen int, którego transkrypcja kończy się tuż za nim (wtedy mechanizm ten nie działa) lub obejmuje także rejon sib. Struktura jego RNA sprawia, że jest bardzo szybko trawiony przez RNazę i gen int nie ulega ekspresji.

Grupa 4
1. Dlaczego wektory fagowe mogą być lepsze od tradycyjnych
- upraszczają klonowanie większych fragmentów DNA (do około 20 kbp)
- wydajnośc infekcji fagiem większa niż transformacji plazmidami
- obecność odcinków cos w liniowej cząsteczce jest istotna (niestety, nie znalazłem dlaczego)
- można łatwo uzyskac duza ilość wektorów poprzez proste pozwolenie fagowi na namnożenie się w kom. gospodarza
- fagi są trwalsze niż plazmidy (z tego co kojarzę)
źródło - internet [link widoczny dla zalogowanych]

2. Co to jest replikacja model toczącego się koła
Zachodzi ona w plazmidach, bakteriofagach i podczas koniugacji. Polega na przecięciu jednej z nici w specyficznym miejscu origin zwanym DSO (double strand origin). Utworzony wolny koniec 3'-OH jest starterem. Replikacja przebiega wokół nieprzeciętej nici bedącej matrycą a druga nić jest odwijana. Po zreplikowaniu odpowiedniego fragmentu genomu (lub całego genomu, nawet kilka razy) nić odwinięta jest odczepiana i dosyntetyzowuje swoją drugą nić.

3. Co to jest intasom,
Kompleks tworzący się w celu umożliwienia wbudowania DNA faga do genomu gospodarza podczas lizogenii. Składa się z DNA faga oraz białek IHF i Int (źródło - internet).

4. Co robią białka P i O i jakie są ich odpowiedniki w E. coli
Odpowiadają za replikację DNA, ich odpowiednikiem u E. Coli są dla o DnaA (inicjator replikacji) (tego nie jestem pewien, ale nic innego mi nie pasuje), dla P - DnaC

5. Co się stanie gdy brak glukozy w pożywce gospodarza (czy jakoś tak) i skutki mutacji w S, CII (chyba) i jeszcze jakiejś innej.
Gdy jest mało glukozy promowana jest droga lizogenii. Wynika to z tego, że w głodującej komórce wzrasta steżenie cAMP, który jest inhibitorem proteazy HflB. Proteaza ta rozkłada białka cII (chyba) i cIII (na pewno). Białko cIII jest białkiem chroniącym cII od rozkładu, a samo białko cII jest promotorem lizogenii. Dzięki temu jego stężenie wzrasta i fag wbudowywuje się do DNA gospodarza.

Mutacja w białku S powoduje, że komórka nie ulega lizie lub przechodzą ją w opóźnieniu. W wyniku tego akumulują nowe cząstki faga wewnątrz siebie. Moga one zostac później uwolnione za pomocą chloroformu.

Mutacja w cII promuje lizę, gdyż nie tworzy się białko cI i transkrypcja jej (lizy) genów nie jest hamowana.

Wyjaśnij termin: plon fagowy.
patrz 2.2

Wyjaśnij w jaki sposób promieniowanie UV doprowadza do indukcji profaga w komórce bakteryjnej.
patrz 1.2

Uzasadnij celowość wprowadzania mutacji w geny kodujace białka kapsydu bakteriofaga lambda.
Możemy je zmutować, by sprawdzić jaką konkretnie rolę odgrywają przy tworzeniu kapsydu, by DNA faga nie mogło do nich wejść (jeśli zależy nam na otrzymaniu tylko DNA faga)

W oparciu o jaki ‘mechanizm molekularny’ funkcjonuje kaskadowy system regulacji genów bakteriofaga lambda? – uzasadnij.
Chyba chodzi o antyterminację. Patrz 1.3

Wyjaśnij termin: centra infekcyjne.
Nigdzie nie znalazłem Sad

Wyjaśnij w jaki sposób uboga pożywka stymuluje wejście faga lambda na drogę lizogenii.
patrz 4.5

Uzasadnij celowość wprowadzania mutacji w geny lizogenii.
Gdy chcemy się upewnić, że bakteria przejdzie lizę. Odpowiednie mutacje mogą sprawić, że liza będzie następować w danych warunkach środowiska, np temperaturowrażliwa wersja białka cI która denaturuje przy około 45 stopniach. Istnieje także mutacja białka cI dająca mu odpornośc na cięcie przez RecA co utrudnia wejście na drogę lityczną już wbudowanego faga. Te mutacje mogą być ważne przy stosowaniu niektórych technik inżynierii genetycznej.

W oparciu o jaki mechanizm molekularny funkcjonuje regulacja genów warunkująca rozwój oraz utrzymanie stanu lizogenii przez faga lambda. Uzasadnij.
I Konkurencja między białkami cI i cro przy wiązaniu się do operatorów oL i oR (działanie antagonistyczne na regulowane promotory)
II Sprzeżenie zworotne. Gdy biało cI już przyłączy się do DNA aktywuje promotor pM odpowiedzialny za swoją własna synteże, przyspieszając ją (dodatnie sprzężenie zwrotne). Gdy białko cI osiągnie w komórce wysokie steżenie zablokuje ono także spój własny promotor, aby nie doprowadzić do nadmiernej ekspresji (ujemne sprzężenie zwrotne)

Wyjaśnij termin:wirus łagodny
Są to wirusy, które moga się wbudować do DNA gospodarza. Nie wywołuja wtedy lizy jego komórek.

Co oznacza termin indukcja profaga i jakie czynniki mogą go wywoływać?
patrz 1.2

Na podstawie bakterifoga lambda wyjaśnij na czym polega zjawisko odporności komórek lizogennych na zakażenie?
patrz 2.5

Co należy wziąć pod uwagę planująć klonowanie z wykorzystaniem wektorów pochodnych bakterifaga lamda?
patrz 3.2

Mateusz

Znalazłem centrum infekcyjne - oczywiście jest w skrypcie.
Centrum infekcyjne (jeśli dobrze zrozumiałem) to po prostu zakażona komórka bakterii, w której fag wszedł na drogę lityczną i która za jakiś czas uwolni fagi, czego skutkiem będzie zakażanie kolejnych bakterii

Natalia

Mateusz

Ad.5 Tak wskazują nasze materiały z organizmów modelowych (strona 9 pdfa z książeczka od filmu, na samej górze), w skrypcie i Sambrooku nie znalazłem nic na ten temat

Ad.2 Możliwe - jak mówię do tego pytania nie mam żadnego pomysłu

Ad.5 OK.