www.biotechugamg.fora.pl

maxi king :)

Żeby było gdzie pytania zapisywać Smile

no i od razu mam pytanko - ta procedura ze skryptu to do ostrego nauczenia się czy tylko do zrozumienia? no i czy sam skrypt wystarczy, jak myślicie? wiem, że nadgorliwość jest gorsza od faszyzmu i normalnie nie zadawałabym takich głupich pytań, ale ma być podobno trudno... Wink

A, i kto myśli, że ten pdf "qiagen cośtam" jest beznadziejny - palec do budki Smile

Janka

pytania z przed dwoch lat z jednej z grup:
1. Jaką metodę izolacji plazmidowego DNA należy zastosować w celu uzyskania dużej iości formy CCC plazmidu?
2. Na jaki proces w komórce bakterii wpływa chloramfenikol?
3. W jakim celu przeprowadzamy ekstrakcję fenolem w czasie izolacji plazmidowego DNA metodą lizy alkalicznej?
4. Na zamieszczonym schemacie przedstawiającym rozdział plazmidowego DNA w żelu agarozowym opisz formy DNA oraz oznacz ładunek elektrod. (są trzy studzienki i pod jedną 3 kreski - trzeba zaznaczyć strzałką że ta najbliżej studzienki to OC DNA, druga(niżej) to liniowe DNA i ostatnia(najniżej) to cccDNA. Przy studzienkach mamy oczywiście elektrodę ujemną, a DNA wędruje do elektordy dodatniej.

Janka

znalazlam jeszcze:
Wejściówka nr.1
1) Opisz schemat przedstawiający próbkę po wirowaniu, w czasie izolacji plazmidowego DNA metodą wirowania w chlorku cezu. (takie schemat jest w skrypcie)
2) Który z powszechnie stosowanych antybiotyków wpływa na prosec syntezy ściany komórkowej bakterii.
3) W jaki sposób usuwamy z próbki białka, w czasie izolacji plazmidowego DNA metodą lizy alkalicznej?
4) Wymień składniki niezbedne w reakcji PCR

ĆW 1
1. W jakim celu dodajemy do próbki r-ru Sol III (octan potansu, lodowaty kw. octowy, woda), w czasie izolacji plazmidowego DNA metodą lizy alkalicznej?
2. Mechanizm oporności na ampicylinę.
3. Uzupełnić zdania: Im większa cząst. DNA tym… (wolniej) migruje w żelu agarozowym. Formy: liniowa, superzwinięta i OC DNA o tej samej sekwencji migrują w żelu z (różną) prędkością. (Duże) stężenie agarozy ułatwia rozdział mniejszych fragmentów DNA. Przyłożenie wyższego napięcia powoduje (wzrost) szybkości migracji DNA w żelu ale także (wzrost) temperatury.
4. Zastosowania PCR
i grupy pierwszej z zeszlego roku:
1.Wymienic skladniki niezbedne w reakcji PCR oraz krótko omówić czynniki wpływające na wydajność reakcji PCR
2.przy oczyszczaniu plazmidowego DNA do czego służy:
a mieszanina fenol:chloroform
boctan potasu
c NaOH
d etanol
3. na czym poleg mechanism oporności bakterii na ampicyline

jaskolczegniazdo

Czy ktoś będzie tak dobry i wyśle mi tę kartkę z pytaniami z 1 wejsciówki co kserowali co po niektórzy??
dziękuje z góry

Martyna

Ola, tam są dokładnie te same pytania, co Janka podała.

aga_b

Nie do końca Martynko.

Ale dzięki uprzejmości Gosi dostałyśmy to dziś w końcu, więc umieszczam, żeby nikt pokrzywdzony nie był Wink

.

[link widoczny dla zalogowanych]

Justyna

A jakie były pytania na dzisiejszej pracowni??

Lukasz

1.wymień czynniki, od których zależywysoka częstość transformacji kom. kompetentnych metodą elektroporacji(5)

2.opisz krótko na czym polega i od czego zależy koniugacja

3.Opisz schemat przedstawiający próbkę po wirowaniu, w czasie izolacji plazmidowego DNA metodą wirowania w chlorku cezu.

4.Jakie było wyjściowe stężenie roztworu CaCl2, jeżeli do przygotowania 100ml roztworu 100mMużyto 5ml?

grzesiek

Dzisiejsze zadania:
1. Co to jest transformacja?
2. W jaki sposob usuwamy bialka w czasie izolacji plazmidowego DNA w metodzie lizy alkalicznej?
3. Jak dziala roztwor CaCl2 na komorki bakteryjne?
4. Jak przygotowac 50 ml roztworu Sol II (1% SDS, 0,2M NaOH) majac do dyspozycj roztwory 1M NaOH i 20% SDS?

aga_b

Moze niech z kazdej grupy jedna osoba napisze pytania ze wszystkich wejsciowek. Babka tak nam dzis radzila, zeby przerobic zadania glownie z wejsciowek co mielismy. Ja nasze zaraz przepisze

aga_b

ĆWICZENIE 1

1. Opisz schemat przedstawiający próbkę po wirowaniu, w czasie izolacji plazmidowego DNA metodą wirowania w chlorku cezu

2. Który z powszechnie stosowanych antybiotyków wpływa na proces syntezy ściany komórkowej bakterii?

3. W jaki sposób usuwamy z próbki białka, w czasie izolacji plazmidowego DNA metodą lizy alkalicznej

4. Wymień składniki niezbędne w reakcji PCR

ĆWICZENIE 2

1. Co to jest transfekcja i koniugacja?

2. Czemu służy inkubacja komórek z CaCl2?

3. Wymień czynniki wpływające na szybkość migracji DNA w żelu agarozowym

4. Co oznacza, że bakterie są naturalnie kompetentne, podaj 2 rodzaje takich bakterii.

ĆWICZENIE 3

1. Wymień 4 metody szacowania poziomu ekspresji danego genu

2. Podpisz elementy na schemacie przedstawiającym próbkę plazmidowego DNA po wirowaniu w chlorku cezu.

3. Uzupełnij:

System ekspresyjny pET pozwala na wydajną ........ w komórkach E.coli. W skład systemu wchodzi promotor t7 zlokalizowany ........... Porpotor ten jest rozpoznawany przez polimerazę ................. której gen jest zlokalizowany ........... i znajduje się pod kontrolą represora ........ ..... Dodanie IPTG do hodowli powoduje modyfikację ....... i aktywację .......... W efekcie ...................................................................................

4. Wymień etapy transformacji komórek kompetentnych E.coli BL21(DE3) uzyskanych za pomocą CaCl2 DNA plazmidowym.
-
-
-
-
-
-
-

5. Standardową procedurą używaną w celu usunięcia zanieczyszczeń białkowych z roztworu zawierającego kwasy nukleinowe jest ............................ Każdy z cykli reakcji PCR składa się z 3 głownych etapów ............... , ............... i ........................ Produkt genu oporności na ................... nie niszczy antybiotyku, co pozwala na zachowanie presji selekcyjnej podczas hodowli bakterii z tym genem oporności. Mechanizm oporności bakterii na ................... opiera sie na hamowaniu syntezy ściany komórkowej bakterii.

ĆWICZENIE 4

1. Które z wymienionych elementów systemu pET znajdują się na:
a)genomie E.coli
b)plazmidzie pET

promotor faga T7
promotor operonu laktozowego
gen kodujący nadprodukowane białko
gen kodujący PolRNA faga T7
gen kodujący represor laktozowy

2. Przygotowano roztwory niezbędne przy oczyszczaniu białka z systemu bakteryjnego. Bufory te zawierały takie samo stężenie soli NaCl oraz jonów fosforanowych, miały natomiast różne stężenie imidazolu.
1- 250 mM
2- 5mM
3- 20 mM
Którego buforu użyjesz do przygotowania lizatu komórkowego, którego do płukania, a którym z nich przeprowadzisz elucję białka ze złoża niklowego? Odpowiedź uzasadnij.

3. Jakie cechy szczepu E.coli BL21(DE3) decydują o tym, że jest on powszechnie wykorzystywany do nadprodukcji białek?

4. Uzupełnij:
Operon arabinozowy zawiera 3 geny araA, araB i araD kodujące ................. , ............. i ................... , ponadto w skład operonu wchodzi gen białka .........(araC), dwa miejsca ........... (araO1, araO2) oraz miejsce wiązania CAP. Operon arabinozowy podlega podwójnej kontroli, do wydajnej transkrypcji konieczne są dwa sygnały: kompleks .............. z CAP oraz arabinoza związana z ......., które jest .................... regulatorem genu ............... Obceność tych 2 czynników umożliwia ......................... przyłączenie .................... genów BAD i ich transkrypcji.

5. Ile należy dodać 1M IPTG do 25ml hodowli bakteryjnej, aby uzyskać stężenie końcowe 1mM IPTG?

6. Jak przygotować 200ml 100mM CaCl2? Do czego taki roztwór może być użyty?

7. Jak przygotować 50ml roztworu SolII (1%SDS; 0,2M NaOH) mając do dyspozycji roztwory: 1M NaOH oraz 20% SDS?

8. Przeprowadzono seryjne rozcieńczenia hodowli płynnej E.Coli BL21(DE3). 100 ul zawiesiny komórek bakterii rozcieńczonych 10^-6 wysiano na płytkę LA z odpowiednim antybiotykiem i inkubowano ją przez noc w 37 C. Na płytce wyrosło 8 kolonii. Jakie jest miano bakterii?

KONIEC:]

marika

ĆWICZENIE 1

1. opisz schemat przedstawiający próbkę po wirowaniu, w czasie izolacji plazmidowego DNA metodą wirowania w chlorku cezu (obrazek ze skrypty)
2. Na czym polega mechanizm oporności komórki bakteryjnej na chloramfenikol?
3. Wymień czynniki wpływające na szybkość migracji DNA w żelu agarozowym (4).
4. Schemat oczyszczania DNA za pomocą lizy alkalicznej. Gdzie znajduje się DNA po ostatnim etapie oczyszczania?

ĆWICZENIE 2
1. Co to jest transformacja?
2. W jaki sposób usuwamy z próbki białka w czasie izolacji plazmidowego DNA metodą lizy alkalicznej?
3. Jak działa roztwór CaCl2 na komórki bakteryjne?
4. Jak przygotować 50ml roztwóru Sol II (1% SDS; 0.2 M NaOH) mając do dyspozycji roztwory 1M NaOH oraz 20% SDS?

ĆWICZENIE 3
1. Uzupełnij wyrazami: induktor, aktywator, promotor, miejsce wiązania aktywatora, miejsce wiązania induktora, geny o indukowanej ekspresji, białko nadprodukowane
(i tu był shcemat operonu arabinozowego)
2. Oczyszczanie jakiej formy plazmidu ma na celu metoda wirowania w gradiencie chlorku cezu?
3. Czy do hodowli komórek kompetentnych dodaje się antybiotyku. Dlaczego?
4. Ile komórek bakteryjnych znajduje się w 100ul hodowli o OD = 0.45?

ĆWICZENIE 4
1. Przeprowadzono seryjne rozcieńczenia hodowli płynnej. 100ul zawiesiny komórek bakterii rozcieńczonych 10-6 wysiano na płytkę i ją inkubowano. Wyrosło 8 kolonii. jakie jest miano bakterii?
2. W celu uzyskania wydajnej nadprodukcji białka w systemie bakteryjnym w genomie bakterii wprowadza się liczne zmiany. Wymień 3.
3. przygotowano roztwory niezbędne do oczyszczania białka z systemu bakteryjnego, bufory różnią się stężeniem imidazolu
bufor 1. zawiera 250 mM imidazolu
bufor 2. zawiera 5mM imidazolu
bufor 3. zawiera 20 mM imidazolu
Którego buforu użyjesz do przygotowania lizatu komórkowego, którego do płukania podłoża, a którym przeprowadzisz elucję białka ze złoża niklowego? odpowiedź uzasadnij.
4. Jak przygotujesz 100ml buforu o składzie 50mM Kpi, 300mM Na Cl, 20mM imidazolu, mając do dyspozycji 1M Kpi, 5M NaCl, i 1M imidazolu

magda

Cwiczenie 1
1.Jaka metode izolacji plazmidowego DNA należy zastosowac w celu uzyskania duzej ilości formy CCC plazmidu?
2.Na jaki proces w komorce bakterii wpływa chloramfenikol?
3.W jakim celu przeprowadzamy ekstrakcje fenolem w czasie izolacji plazmidowego DNA metoda lizy alkalicznej?
4. Na zamieszczonym schemacie, przedstawiającym rozdzial plazmidowego DNA w zelu agarozowy opisz formy DNA oraz zaznacz ładunek elektrod.
Cwiczenie 2
1.Wymien czynniki, od których zalezy wysoka częstość transformacji Komorek kompetentnych metoda elektroporacji.
2.Opisz krotko na czym polega i od czego zalezy koniugacja.
3.Opisz schemat przedstawiajacy próbkę po wirowaniu, w czasie izolacji plazmidowego DNA metoda wirowania w chlorku cezu.
4. Jakie było wyjściowe stezenie roztworu CaCl2, jeżeli do przygotowania 100ml roztworu 100mM uzyto 5ml?
Cwiczenie 3
1.Opisz krotko dwie z metod transformacji Komorek ssaczych.
2. Na czym polega mechanizm indukcji ekspresji bialka, którego gen znajduje się pod kontrola promotora arabinozowego.
3.Jaka była wydajnosc transformacji bak E.coli, jeśli do transformacji uzyto 500ng plazm DNA, a po inkubacji w temp 370C przez 24h, na plytce z antybiotykiem wyrosło 450 kolonii.
4.W jaki sposób można okreslic poziom ekspresji genow w kom?
Cwiczenie 4
1.Przeprowadzono seryjne rozcieńczenia hodowli płynnej E.Coli BL21(DE3). 100 ul zawiesiny komórek bakterii rozcieńczonych 10^-6 wysiano na płytkę LA z odpowiednim antybiotykiem i inkubowano ją przez noc w 37 C. Na płytce wyrosło 15 kolonii. Jakie jest miano bakterii?
2.Jakie cechy powinny posiadac szczep bakterii E.coli oraz plazmid ekspresyjny, uzyte do nadprodukcji bialka?
3. Co spowoduje dodanie do zloza niklowego, na którym związane jest bialko ze znacznikiem histydynowym, buforu zawierającego 250mM imidazol, a co buforu z 250mM EDTA.
4. W jakich warunkach można przechowywac oczyszczone bialko przed dłuższy czas.

aga_b

Jakie sa czynniki od ktorych zalezy czestosc transformacji metoda elektroporacji? Bo jakos nie moge tego znalezc napisanego, a nie wiem czy to co sobie sama wymyslilam wystarczy:D

jaskolczegniazdo

moim skromnym zdaniem:

-stęż DNA no i konformacja jego (pamiętajmy TEN DNA:D Very Happy

)
-napięcie/natężenie, które nigdy nie wiem,babka u nas też nie wiedziała,niby jedno wynika z drugiego:P
-długość trwania impulsu,
-faza wzrostu kk,
-rodzaj buforu czy tam jego stężenie
-i Gosia mówiła jeszcze mi, że wzór metylacji